Técnica permite sequenciar o genoma do vírus causador da varíola dos macacos em apenas 18 horas

Protocolo desenvolvido por grupo do Centro Conjunto Brasil-Reino Unido para Descoberta, Diagnóstico, Genômica e Epidemiologia de Arbovírus foi usado para analisar amostra do primeiro paciente com diagnóstico confirmado no Brasil. Tecnologia poderá ser útil para detectar novos vírus emergentes

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Karina Toledo | Agência FAPESP – Pesquisadores do Centro Conjunto Brasil-Reino Unido para Descoberta, Diagnóstico, Genômica e Epidemiologia de Arbovírus (CADDE) concluíram em apenas 18 horas o sequenciamento completo do genoma do vírus monkeypox (MPXV) isolado do primeiro paciente com diagnóstico de varíola dos macacos confirmado no Brasil.

O feito tornou-se possível graças à adaptação para o MPXV de uma técnica de metagenômica rápida desenvolvida durante o doutorado de Ingra Morales Clarobolsista da FAPESP. O trabalho foi coordenado pela professora da Universidade de São Paulo (USP) Ester Sabino, que também esteve à frente do primeiro sequenciamento de SARS-CoV-2 no país, em março de 2020, e dos primeiros casos da nova variante gama, surgidos em Manaus cerca de um ano depois (leia mais em: agencia.fapesp.br/32637/ agencia.fapesp.br/35290/).

A equipe do CADDE divulgou os resultados ontem (09/06) no virological.org, site em que virologistas de todo o mundo compartilham informações sobre patógenos de interesse em tempo real.

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“Recebemos a amostra de um paciente internado no Hospital Emílio Ribas às 16 horas de terça-feira [07/06] e às 10 horas da manhã seguinte o genoma do vírus, que tem quase 200 mil pares de bases [bem mais que as 30 mil do SARS-CoV-2], estava sequenciado e analisado. A metodologia que desenvolvemos é, em média, 45% mais rápida do que as técnicas de metagenômica convencionais. E o custo também é menor, podendo chegar a US$ 30 por amostra”, conta Claro à Agência FAPESP.

Como explica Sabino, os cientistas costumam recorrer a análises metagenômicas quando precisam identificar um novo vírus emergente (como foi o caso do SARS-CoV-2 em 2019) ou detectar em amostras de pacientes um vírus já conhecido sem ter em mãos os reagentes específicos necessários (como ocorre agora com o MPXV).

Isso porque o teste de RT-PCR, padrão-ouro para diagnóstico da COVID-19 e de várias outras doenças, requer os chamados primers (iniciadores), que são sequências de nucleotídeos complementares às sequências virais que iniciam a replicação do material genético. E o resultado depois precisa ser comparado com controles negativos e positivos.

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“Quando tem início uma epidemia por um agente infeccioso novo, um dos grandes gargalos para o diagnóstico dos casos é a falta de primers específicos e de controles positivos. Essa técnica pode ser útil nessas situações, pois permite identificar patógenos ainda desconhecidos, para os quais não há reagentes”, explica Sabino.

E quanto mais cedo ocorre a detecção do caso “index” (o primeiro caso), maior a probabilidade de contenção de um vírus emergente, acrescenta Claro.

No caso da metagenômica são usados primers aleatórios (não específicos para um determinado vírus ou bactéria), que possibilitam sequenciar todo o material genético contido em uma amostra biológica, inclusive o do hospedeiro (humano, no caso) e de outros patógenos que ele eventualmente albergue. Em seguida, essas informações são analisadas por técnicas de bioinformática e comparadas com um painel de referências.

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“Exatamente como foi feito com o MPXV. Os dados obtidos foram mapeados em uma sequência do vírus já disponível para estudos. E isso nos permitiu comprovar que se tratava do monkeypox”, diz Claro.

Encurtando caminhos

A confirmação oficial do primeiro caso brasileiro de varíola dos macacos foi feita ontem (09/06) pelo Instituto Adolfo Lutz. O laboratório de referência paulista conduziu a análise metagenômica em uma plataforma conhecida como Illumina, uma das tecnologias que tem sido usada para detectar o MPXV nos centros europeus e norte-americanos e considerada padrão-ouro. O sequenciamento por esse método leva em média 48 horas para ser concluído.

Já o grupo do CADDE usou um sequenciador portátil conhecido como MinION, da Oxford Nanopore Technologies, e fez adaptações no protocolo usado para sequenciar o vírus zika (a partir de 2015) e o SARS-CoV-2 (a partir de 2020), tornando-o mais rápido.

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“Uma das vantagens deste novo protocolo é a redução no tempo de preparo da amostra para sequenciamento, que passa de 14 horas para 5h40 minutos”, relata Claro.

Como a taxa de erro é um pouco mais elevada que a da plataforma Illumina, a equipe do CADDE buscou gerar até 300 leituras (reads) redundantes para cada região do genoma viral. “Quando cobrimos diversas vezes a mesma região e encontramos o mesmo resultado, podemos ter certeza de que não se trata de um erro de leitura”, diz a pesquisadora.

O passo seguinte foi montar a árvore filogenética do MPXV isolado no Brasil. Para isso, a equipe do CADDE comparou a sequência obtida na USP com outras 102 divulgadas este ano por cientistas de países como Bélgica, Portugal, Reino Unido, Alemanha, Espanha e Estados Unidos. O objetivo foi mensurar o grau de similaridade entre as sequências, o que dá pistas sobre as relações evolutivas.

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“Baixamos todos os genomas completos sequenciados em 2022 [até 09/06], alinhamos as sequências e montamos a árvore filogenética. Vimos que o MPXV detectado aqui se encaixa em um grande clado [grupo], o mesmo em que estão os vírus sequenciados na Europa e nos Estados Unidos. Quando comparamos com o genoma de referência do CDC [o Centro de Controle de Doenças norte-americano], atualizado em maio, observamos somente três mutações”, conta Claro.

A título de comparação, o primeiro genoma de MPXV sequenciado em 2022 apresentou 47 mutações em relação ao último caso até então descrito (em 2018, na África).

“O que essas mutações representam e se de alguma forma elas contribuíram para o aumento no número de casos é algo que ainda está sendo estudado por outros grupos de pesquisa. Nós aqui no CADDE vamos ficar de olho nos próximos casos. A ideia é continuar sequenciando para monitorar a evolução do vírus”, revela Claro.

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Embora seja conhecido por causar a varíola dos macacos ou varíola símia, o MPXV é um vírus que infecta principalmente roedores na África. O patógeno integra a família Orthopoxvirus, a mesma do vírus da varíola humana, erradicada em 1980.

A doença geralmente começa com febre, fadiga, dor de cabeça, dores musculares, ou seja, sintomas inespecíficos e semelhantes aos de resfriado ou gripe. Alguns dias após o início da febre aparecem as lesões na pele, que contêm alta carga viral. A disseminação se dá pelo contato direto com as feridas ou com roupas, lençóis e toalhas usadas por alguém com as lesões na pele. Também pode ocorrer pela tosse ou espirro de pessoas infectadas.

Até o início deste ano, a infecção era comum apenas na África Central. Mas novos casos já foram detectados em 33 países, a maioria sem histórico prévio da doença.

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